gİRİŞAlfabetik Ödüllü kişi arama
Roger D. Kornberg
Benim yetişkin bilimsel kariyer, Stanford Üniversitesi'nde Harden McConnell ile kimyasal fizik yüksek lisans çalışması ile başladı. Nükleer rezonans biyolojik membranları arasında iyon taşıma mekanizması nedenlerine açıklık fikrim yoktu. Iyon taşıma, membran taşıyıcı protein dönme içermelidir. Bu yanlış fikir kanıtlamak için mücadele, 1.000 molekül ağırlığı yerine, elli kat daha büyük bir protein ile ilgili bir lipid molekülü membran dönüş çalışma bana oluştu. Bu fosfolipid nükleer ve paramanyetik rezonans yöntemleri, flip-flop, son derece yavaş bir süreç ve lateral difüzyon, son derece hızlı (Kornberg ve McConnell, 1971b Kornberg ve McConnell, 1971a), keşifler yol açtı.
Doktora sonrası çalışmaları için, diğer önemli makromoleküller, X-ışını kırınımı fiziko-kimyasal analiz yöntemi hakkında bilgi istedi. Aşikar seçim protein kristalografisi zamanda geliştirilen ve hala en yoğun uygulandığı Cambridge, Moleküler Biyoloji Laboratuvarı (LMB) oldu. Ben sadece bir lider kristalbilimciydi değildi Aaron Klug ile çalışmak için 1972 yılının baharında gitti, ama aynı zamanda, elektron mikroskobu ve görüntü işleme Fourier yöntemleri uygulama için sorumlu. X-ışını kırınım çalışması için bir sorun ararken, ben bilmek Mark Bretscher, membran yapısı ile ilgilenen LMB tek kişi var, ve o Yüksek Organizma "Genel Bir Model başlıklı Francis Crick tarafından yayımlanan bir makalede, okuma önerdi Kromozomlar "(Crick, 1971). Bu kağıt Şekil 3 kesik bir çizgi ile çapraz DNA'nın bir döngü gösteren bir diyagram, bir histon molekülünün sembolize söyledi. Aaron Klug konu kaldırdı, o hemen X-ray, kromozom malzeme analizi, ya da neredeyse bir yüzyıl boyunca, histon ve DNA kabaca eşit ağırlıklar içeren bilinen "kromatin," kağıtları bir demet üretti. Aaron, X-ray Francis ile yoğun kromatin paterni yorumlanması ele aldıklarını ve bana sorun sürdürmeye teşvik etti. O bir "dağınık" sorunu olduğunu, ancak, beni uyardı.
Notorious daha iyi bir kelime olabilir. Çoğu sadece histon inatçılık sinirli olması, genetik kimya içgörü potansiyeli ile, sorunun cazibesini yenik vardı. Bu proteinler, bir taraftan, şaşırtıcı derecede basit, ve diğer taraftan, umutsuzca karmaşık. Histon sadece beş tür, belirlenen H1, H2A, H2B, H3, H4 vardır. Ancak, izolasyon üzerine bireysel histon heyecanla DNA bağlayıcı ve mümkün olan her kombinasyonu birbirleriyle etkileşim olağanüstü yapışkan kanıtladı. X-ışını kırınım deseni kromatin düzeni tekrar göstergesi iken, histon biyokimyasal davranışı açıklamak için ortaya çıkmadı. (Huberman, 1973), "savunulamaz eşsiz bir yinelenen amacıyla fikir" histon türleri, çeşitli doku ve organizmalarda göreceli miktarları yeterli varyasyon, dahası vardı. Histon hiçbir belirgin öneme sahip, amorf tutkal, kaplama kromozomal DNA bir tür olarak kabul edilmeye başlandı.
DNA ve kayıt X-ışını kırınım desenleri ile çeşitli kombinasyonlarda karıştırma, bireysel histon tecrit, başkalarının çalışmalarına tekrar başladı. Ben de edebiyat temizliği ve düşünme etkiledi iki makale karşılaştım. Hewish ve Burgoyne bir kağıt, bir birim boyutu (Hewish ve Burgoyne, 1973) katları yaklaşık% 10 oranında kromozomal DNA izole sıçan karaciğer çekirdekleri endojen bir nükleaz dilinim bildirdi. Francis Crick bu bahsedilen, o boyutu hakkında soran Hewish bir mektup uçurdum. DNA birim uzunluğu sedimantasyon katsayısı cevap vererek, Burgoyne geldi. Ölçüm zamanda çok LMB okudu RNA sedimentasyon analizi, alışılmış olduğu gibi, alkali şartlar altında yapıldı varsayılarak, Burgoyne değeri yaklaşık 500 üsleri karşılık gelmektedir. Bu birim büyüklüğü kromatin hakkında başka bir bilgi vermedi, birim büyüklüğü ve katları görünümünü sadece kromatin altyapı tekrar bir miktar yer alan X-ray difraksiyon, biz zaten bildiğini doğruluyordu.
Van der Westhuyzen ve von Holt tarafından ikinci kağıt, kromatin ile histon hafif yöntemlerle ekstraksiyon, güçlü asit veya diğer kötü muamele ile değil, aynı zaman (van der Westhuyzen ve von Holt, 1971) gelenekti bildirdi. Hafif yöntemleri birbirinden tamamen histon çözmek için başarısız oldu, bu yüzden kağıt göz ardı edildi. , Benim dikkatimi iki grup, H2A/H2B ve H3/H4 hafif çıkarılan histon temiz ayırma çekti. Bu ayırma, daha önce görülen histon promiscuous etkileşimler ile çelişiyor. Bu gelişigüzellik geçmişte izolasyonu sırasında histon denatürasyon muhtemelen etkili olmuştur gerçekleştirdi. Kağıt verilere göre, ben de H3/H4 grubu dört ayrı histon proteinler aynı boyutta olmasına rağmen, H2A/H2B grubun iki katı büyüklüğünde sanki davrandıklarını olmadan. H3 ve H4 dimer formu gerektiği sonucuna vardı ve ben bu eşsiz histon oligomer yapısı kristalize ve çözebilir.
Bunu gerçekten şaşırtıcı idi. Jean Thomas kimyasal çapraz bağlama malzemeleri analiz etmek için teklif ederken, denge Ultrasantrifügasyon arındırılmış hazırlık H3/H4 molekül ağırlığı ölçülür. Her iki yöntem de, H3, H4, çift dimer formu (H3) 2 (H4) 2 tetramer (Kornberg ve Thomas, 1974) su götürmez olduğunu gösterdi. Ben bu gün düşünüp taşındı ve, (Kornberg, 1974) aşağıdaki sonuçlara geldi. Birincisi, tetramer H3 ve H4 tam denklik geçmişte ölçülen çeşitli kaynaklardan histon göreceli miktarları farklılıklar deneysel hata nedeniyle olması gerektiğini ima etti. Bu ve tetramer stokiyometri dört histon her iki ya da (H2A) 2 (H2B) 2 (H3) 2 (H4) 2 Oktamer dayalı kromatin yapısı ile ilgili bir birim ima etti. İkincisi, tüm kaynaklardan kromatin kabaca her 100 bp DNA histon her biri içerdiğinden, histon Oktamer 200 bp DNA ile ilişkili olacaktır. Son olarak, (H3) 2 (H4) 2 tetramer, hemoglobin, A2B2 tetramer hatırlatıyordu. X-ray yapıları hemoglobin ve diğer oligomerik proteinler anda mevcut bir molekül, DNA boyutu bayılacakmış delik, kompakt. Aksine, Kromatin DNA histon Oktamer dışında sarılmış olmalıdır.
Bu fikirler aklımda üzerinde döndü, ben Hewish ve Burgoyne sonuçları nasıl açıklayabilir bana vurdu. Birim uzunluk DNA parçalarının, sedimantasyon katsayısı alkali şartlar yerine nötr altında ölçüldü? Sonra DNA'nın çift zincirli ve yaklaşık 250 bp uzunluğunda olurdu. 200 bp öngörü ile yazışmalar sonucu yaklaşık doğa için izin vermek, heyecan oldu. Sonra DNA parçalarının Williamson tarafından benzer bir model ile ilgili bir rapor Hewish ve Burgoyne kağıt sonuna yakın bir referans hatırlattı. Kütüphaneye koştu ve Williamson, nekrotik hücrelerin sitoplazma DNA parçalarının bir merdiven Nötr koşullar altında elde edilen ve sedimantasyon tarafından ölçülen birim boyutu olduğunu bulundu: sonucu 205 bp oldu! Öforik oldu. Ay ve yıl takip etmek, çoğu zaman, benim fikir ve akıl yürütme çizgi ne kadar uzun destek oldu ne kadar ince sivri, ama gerçekten sonuçlar hiç şüphe oldu. DNA birim büyüklüğü ve doğrulama tahmin tamamen beni ikna etti.
Elektron mikroskobu ve nükleaz sindirim ve sedimentasyon analizi kromatin bir partikül altyapı için destek geldi. Önce kendi bile bu satırları üzerinde bazı çalışmalar yapılır ve kesin olsa da, benim fikirlerim güzel tesadüf değildi. Cambridge meslektaşları ile, takip eden yıllarda, ben histon Oktamer varlığını ve parçacık elektron mikroskobu ile 200 bp birimi (Kornberg, 1977) denklik kanıtladı. Kromatin hikaye bu bölümü atom detay (Luger ve ark, 1997) yakın, DNA tarafından çevrili bir histon Oktamer gösteren parçacığın nucleosome olarak bilinen X-ray kristal yapı tayini, ile sona erdi.
My adult scientific career began with graduate study in chemical physics with Harden McConnell at Stanford. I had the idea of elucidating the mechanism of ion transport across biological membranes by nuclear resonance. I thought ion transport must involve rotation of the transport protein in the membrane. Struggling to prove this wrong idea, it occurred to me to study the rotation in the membrane of a lipid molecule, about 1,000 molecular weight, rather than a protein fifty times larger. This led to my discoveries, by nuclear and paramagnetic resonance methods, of phospholipid flip-flop, an exceedingly slow process, and lateral diffusion, exceedingly fast (Kornberg and McConnell, 1971a ; Kornberg and McConnell, 1971b).
For postdoctoral work, I wanted to learn about the other important method of physico-chemical analysis of macromolecules, X-ray diffraction. The obvious choice was the Laboratory of Molecular Biology (LMB) in Cambridge, where protein crystallography was developed and still most intensively practiced at the time. I went in the spring of 1972 to work with Aaron Klug, who was not only a leading crystallographer, but also responsible for the application of Fourier methods to electron microscopy and image processing. While looking for a problem to study by X-ray diffraction, I got to know Mark Bretscher, the only person at the LMB interested in membrane structure, and he suggested reading a paper just published by Francis Crick titled "A General Model for Higher Organism Chromosomes" (Crick, 1971). Figure 3 of that paper was a diagram showing a loop of DNA crossed by a dashed line, said to symbolize a histone molecule. When I raised the subject with Aaron Klug, he immediately produced a sheaf of papers on the X-ray analysis of chromosomal material, or "chromatin," known for nearly a century to contain roughly equal weights of histones and DNA. Aaron had discussed the interpretation of the X-ray pattern of chromatin extensively with Francis, and he encouraged me to pursue the problem. He warned me, however, that it was a "messy" problem.
Notorious might have been a better word. Many had succumbed to the allure of the problem, with its potential for insight into genetic chemistry, only to be frustrated by the intractability of the histones. These proteins were, on the one hand, surprisingly simple, and on the other hand, hopelessly complicated. There are only five types of histone, designated H1, H2A, H2B, H3, and H4. Upon isolation, however, the individual histones proved to be extraordinarily sticky, binding avidly to DNA and interacting with one another in every possible combination. Whereas the X-ray diffraction pattern of chromatin was indicative of repeating order, the biochemical behavior of the histones did not appear to explain it. There was, moreover, sufficient variation in the relative amounts of the histone types in various tissues and organisms "to make the idea of a unique repeating order untenable" (Huberman, 1973). The histones came to be regarded as a kind of amorphous glue, coating the chromosomal DNA, with no obvious significance.
I began by repeating the work of others, isolating the individual histones, mixing them in various combinations with DNA, and recording X-ray diffraction patterns. I also scoured the literature and came across two papers that influenced my thinking. A paper by Hewish and Burgoyne reported the cleavage of about 10% of chromosomal DNA by an endogenous nuclease in isolated rat liver nuclei to multiples of a unit size (Hewish and Burgoyne, 1973). When I mentioned this to Francis Crick, he shot off a letter to Hewish inquiring about the size. The reply came from Burgoyne, giving the sedimentation coefficient of the unit length of DNA. Assuming the measurement was made under alkaline conditions, as was customary for sedimentation analysis of RNA, much studied at the LMB at the time, the value from Burgoyne corresponded to about 500 bases. This unit size did not relate to any other information about chromatin, and the appearance of multiples of the unit size simply confirmed what we already knew from X-ray diffraction, that chromatin contained some amount of repeating substructure.
The second paper, by van der Westhuyzen and von Holt, reported the extraction of histones from chromatin by mild methods, rather than with strong acid or other harsh treatment, as was customary at the time (van der Westhuyzen and von Holt, 1971). Mild methods failed to resolve the histones entirely from one another, so the paper was ignored. What attracted my attention was the clean separation of the mildly extracted histones into two groups, H2A/H2B, and H3/H4. This separation contrasted with the promiscuous interactions of the histones previously observed. I realized this promiscuity was likely attributable to the denaturation of histones during isolation in the past. From the data in the paper, I could also deduce that the H3/H4 group behaved as if twice the size of the H2A/H2B group, although all four individual histone proteins were about the same size. I concluded that H3 and H4 must form a dimer, and I thought I might crystallize and solve the structure of this unique histone oligomer.
What followed was truly astounding. I measured the molecular weight of the purified H3/H4 preparation by equilibrium ultracentrifugation, while Jean Thomas offered to analyze the material by chemical cross-linking. Both methods showed unequivocally that H3 and H4 were in the form of a double dimer, an (H3)2(H4)2 tetramer (Kornberg and Thomas, 1974). I pondered this result for days, and came to the following conclusions (Kornberg, 1974). First, the exact equivalence of H3 and H4 in the tetramer implied that the differences in relative amounts of the histones from various sources measured in the past must be due to experimental error. This and the stoichiometry of the tetramer implied a unit of structure in chromatin based on two each of the four histones, or an (H2A)2(H2B)2(H3)2(H4)2 octamer. Second, since chromatin from all sources contains roughly one of each histone for every 100 bp of DNA, a histone octamer would be associated with 200 bp of DNA. Finally, the (H3)2(H4)2 tetramer was reminiscent of hemoglobin, an a2b2 tetramer. The X-ray structures of hemoglobin and other oligomeric proteins available at the time were compact, with no holes through which a molecule the size of DNA might pass. Rather, the DNA in chromatin must be wrapped on the outside of the histone octamer.
As I turned these ideas over in mind, it struck me how I might explain the results of Hewish and Burgoyne. What if their sedimentation coefficient of unit length DNA fragments was measured under neutral rather than alkaline conditions? Then the DNA would have been double stranded and about 250 bp in length. Allowing for the approximate nature of the result, the correspondence with my prediction of 200 bp was electrifying. Then I recalled a reference near the end of the Hewish and Burgoyne paper to a report of a similar pattern of DNA fragments by Williamson. I rushed to the library and found that Williamson had obtained a ladder of DNA fragments from the cytoplasm of necrotic cells and measured the unit size by sedimentation under neutral conditions: the result was 205 bp! I was euphoric. In the months and years to follow, it was often pointed out how thin was the support for my ideas and how extended the line of reasoning, but I never really doubted the conclusions. The prediction of the DNA unit size and its verification convinced me completely.
Support for a particulate substructure of chromatin came from electron microscopy and from nuclease digestion and sedimentation analysis. Some work on these lines was done even before my own, and though not definitive, was nicely coincident with my ideas. In the years to follow, with colleagues in Cambridge, I proved the existence of the histone octamer and the equivalence of the 200 bp unit with the particle seen in the electron microscope (Kornberg, 1977). This chapter of the chromatin story concluded with the X-ray crystal structure determination of the particle, now known as the nucleosome, showing a histone octamer surrounded by DNA, in near atomic detail (Luger et al., 1997).